靶向用药丨MSI位点及检测方法如何选？
祝各位元宵节快乐，快快关注我们吧！
MSI该如何检测？检测哪些位点？
在临床医生的脑海里，一般都会默认MMR基因缺陷（dMMR）=高频微卫星不稳定性（MSI-H），MMR基因正常（pMMR）=低频微卫星不稳定性（MSH-L）或微卫星稳定（MSS），只要检测dMMR就可以了，虽然两者一致率高达到90%以上，但其实并不能够达到100%。
dMMR：MMR基因缺失；pMMR：MMR基因正常；MSI-H：高度微卫星不稳定；MSI-L：低度微卫星不稳定；MSS：微卫星稳定。更多基础背景知识请参见：广谱免疫药物Biomarker之MSI。
关于MMR及MSI的概念，相信大家并不陌生，特别是PD-1/PD-L1免疫疗法如此火热的情况下，MMR及MSI几乎成为了必检的生物标志物；其次在结直肠癌中，也成了林奇综合征、评估5-FU化疗疗效及预后的必检生物标志物。
微卫星不稳定（Microsatallite Instability，MSI）表现于同一微卫星位点在不同个体之间以及同一个体的正常组织与某些异常组织之间，微卫星位点的重复单位的数目不同。MSI的产生原因可能是DNA复制过程中的“链滑”（strand slippage）现象。DNA复制过程中， 当复制复合物复制一个重复单位（repeat unit）后，子链与模板链分离，然后与下一个或下几个重复单位重新结合，使一个或几个重复单位形成“环凸”（looped out）区域。正常情况下该结构可被错配修复系统（mimatch repair system）所校正，但校正系统失常时，子链DNA如继续延伸即可引起突变。这就引起微卫星不稳定，基因型发生变化。
人基因组中至少有500000个微卫星，由于MMR缺陷并非影响给定给定肿瘤中的所有微卫星，研究一个以上微卫星和研究常受不稳定性影响的微卫星很重要。由于微卫星标记最初由研究人员根据他们自己的实验非常随机低挑选，所以目前MSI的诊断方法中主要使用的有三个Panel。
美国国家肿瘤研究所（NCI）于1997年12月公布的经典 Bethesda panel，当时在Bethesda,MD举行了会议来讨论该问题，并提出建议来促进研究之间的一致性，这导致称为 Bethesda 系列的“金标准”标记系列的推荐。此系列包含2个单核苷酸（BAT-25、BAT-26）与3个双核苷酸（D2S123、D5S346、D17S250），如果MSI≥30%（40%）或更多的，则称为MSI-H，10%~29%的称为MSI-L，10%以下的称为MSS，MSI-L与MSS的区分只有在选用更多位点来进行检测时才能实现，不过MSI-L与MSS的肿瘤表型似乎一致。
虽然目前仍认为Bethesda系列是标准，但已知它具有比较低的敏感性（取决于哪一个MMR基因突变），对于具有MLH1突变的患者，敏感性为80%，具有MSH6突变的患者，它仅为55%，这时候可以通过加入其它标记来改善，但实际上为MSI-H的患者仍可以呈现出MSI-L或MSS。还有一个问题，我觉得Bethesda系列仅推荐用于结直肠癌，即使已知其它显示MSI的癌症，似乎由于这样的事实，这5个标志物是非常随机地鉴定为在微卫星不稳定结直肠癌中突变，但生物学机制并不清楚。
目前大部分的MSI数据均是针对欧美人群，对于东亚裔人群的MSI发生率，目前已报到的数据提示略低于欧美人群， 2017年新发表的数据提示（Futural Oncol，多中心研究）东亚裔结直肠癌患者更适合NCI panel。
2002年，NCI在第二次专题会议上针对之前采纳的NCI panel来检测MSI问题出现了争议，争议的焦点在于：由于NCI panel使用了3个双核苷酸重复的位点，导致应用NCI panel来评估肿瘤微卫星不稳定状态时存在一定的局限性，其一，双核苷酸重复的位点在检测存在错配修复缺陷的肿瘤时表现出较低的特异性和灵敏度；其二，由于双核苷酸重复位点具有高多态性的特征，故检测时必须用与肿瘤组织匹配的正常组织来作比较才能得出结果，会议建议专用单核苷酸重复位点来检测MSI以提高检测的灵敏度。
2002年，Hamelin和他的同事们提出了一个新的由5个准单态性单核苷酸标记物组成的panel，被称为Pentaplex panel，它被证明能够准确地鉴定MSI肿瘤，而不需要匹配正常的DNA，Pentaplex panel，包含单纯的5个单核苷酸位点（BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-22、NR-24）。该Pentaplex panel与Bethesda panel相比，具有更高的灵敏度和特异性。
查找高度灵敏性及特异性的用来检测MSI的准单态性位点是建立MSI检测体系的必须工作，但是这一工作并不轻松，到目前为止仅有Promega公司的一款产品（MSI Analysis System）能够一次检测5个准单态性单核苷酸位点，包括BAT-25，BAT-26，NR-21，NR-24，MONO-27及两个质控的5核苷酸重复位点（Penta-C ＆ Penta-D）。
美国Promega公司生产的 MSI Analysis System, Version 1.2 ，是以荧光多重PCR为基础来检测人类细胞中微卫星不稳定性的方法。典型的MSI分析是将分别扩增自正常和待测样品（可能有错配修复缺陷）的DNA产生的微卫星标志物等位基因谱进行比较。若等位基因在待测样品中出现，但在相应的正常样品中不能检出，则提示存在MSI。Promega panel可以表现出更高的灵敏度和准确性，目前已被许多研究引用和认可。
近年来，已有很多包含更多单核苷酸检测位点的MSI检测商用试剂盒出现，各种各样的MSI panel层出不穷，比如艾德：NR-24、BAT-25、CAT-25、BAT-26、MONO-27，比如阅微基因：NR-21，NR-22，NR-24，NR-27，BAT-25，BAT-26，MONO-27，CAT-25（最为常见8个），还有其他试剂盒：BAT-25，BAT-26，NR-21，NR-24，NR-27等，大致都是这些位点进行了不同的组合，至于哪个更准确，到现在也没有标准。
目前MSI常用的检测方法主要有四种：
1. 免疫组化方法（IHC）：
免疫组化方法仅用于与肿瘤细胞中的MLH1, MSH2, MSH6和PMS2蛋白结合。如果没有结合任何的蛋白，就证明发生了MSI。
2. 直接测序法（毛细管电泳）：
对MMR基因各区域（MLH1、MSH2、MSH6等）的扩增产物直接测序。
3. 多重荧光PCR法（毛细管电泳）：
采用多重荧光PCR的方法对MSI位点进行扩增，以确定MSI状态。该方法也是目前MSI检测的金标准。
4. NGS检测法：
采用NGS技术检测MSI位点序列及丰度，进而确定MSI状态，用NGS检测MSI已经成为了一种常见技术手段。
2017年11月16日，MSK的IMPACT™产品获批，能够检测肿瘤组织中的体细胞单核突变/插入/缺失以及微卫星不稳定性（MSI），对于MSI的检测，IMPACT™与传统方法检测结果的一致性高达92%以上。2017年11月30日FMI的NGS产品F1CDX被FDA批准，检测范围包括了肿瘤突变负荷（TMB）及微卫星不稳定性（MSI）。
传统PCR方法与NGS方法比对
由于NGS检测通量高，灵敏度及特异性强，在NGS Panel中加入MSI检测，能够一次性检测多个MSI位点，无疑会是后续MSI检测的一个重要方法。
目前国内肿瘤基因检测市场已有多个公司进行MSI二代测序的检测，不同公司做的MSI位点及数目也是不同的，比如泛生子：BAT-25，BAT-26，NR-21，NR-24，MONO-27；海普洛斯：BAT-25，BAT-26，NR-21，NR-24，NR-27。同时也有很多公司在开发更多的MSI位点panel，比如燃石和世和等，燃石可检测63个MSI位点，13个（20%）以上判断为MSI-H，9-12（14%-19%）判断为MSI-L，低于9个（14%）判断为MSS；世和为22个MSI位点；华大为16个MSI位点。除了最为常见8个MSI位点，其他的MSI位点多数为科研性质的，识别良好区分MSI位点需要好的算法和大量样本的积累验证，同时重复序列的捕获和检测分析等流程也是需要克服一定的困难，小编目前暂未收集到其他公司释放的MSI-NGS检测性能信息，在此不做过多评价。
虽然NGS检测MSI有许多的优势，但是通过NGS方法目前尚不能确定MSI-L或MSI-H状态，每家公司的评判标准均不一样，尤其是选取的MSI位点与MMR对应的关系。
一、MSI最开始主要在结直肠癌中进行研究，而且结直肠癌是一种遗传异质性的疾病。约15%的结直肠癌存在染色体组不稳定性，而染色体组不稳定，是由于不同程度的微卫星不稳定造成的，其中3%为Lynch综合征，另外12%为散发性。
林奇综合征（HNPCC）：常染色体显性遗传病，由于生殖细胞中携带有MMR基因突变而造成MMR功能缺陷引起MSI，MLH1，MSH2，MSH6，PMS2是常见的4种MMR蛋白。
散发性MSI相关结直肠癌：与林奇综合征最大的不同，是因为其并不是由于错配修复基因（MMR）生殖细胞突变导致的，而是因MLH1基因启动子甲基化导致MLH1基因发生表观遗传学沉默或BRAF V600E突变所致致MMR基因沉默。
Lynch综合征的筛查流程
此外，TNM Ⅱ期或Ⅲ期的CRC伴 MSI-H 的患者预后更好，但接受 5-FU 为基础的辅助化疗并不获益，而对含奥沙利铂或伊立替康的化疗有效。
二、肿瘤免疫治疗是近年来肿瘤治疗中最令人兴奋的发展，尤其是PD-1/PD-L1免疫疗法已成为当今热门话题。
2017年5月23日，FDA加速批准于治疗错配修复缺失型（dMMR）/高度微卫星不稳定性（MSI-H）不可切除或转移性成人和儿童患者。2017年8月1日，FDA加速批准 OPDIVO（nivolumab）用于治疗错配修复缺失型（dMMR）/高度微卫星不稳定性（MSI-H）的12 岁以上转移性结直肠癌患者。 MSI-H的检测方法用的是基于PCR的方法-Promega的试剂盒。
主要机理：基因错配修复缺陷（dMMR）-->引起微卫星不稳定性（MSI）-->无法修复的基因在各种外在环境影响下开始突变，越来越多，肿瘤突变负荷（TMB）增加，进而产生了相关新抗原-->淋巴细胞受到调动，抑制肿瘤生长，形成肿瘤浸润淋巴细胞。
免疫治疗与dMMR（MSI-H）
1，dMMR蛋白主要通过免疫组化法（IHC）检测，蛋白表达正常提示为MSI-L/MSS，只要有任何一个蛋白功能缺陷，即提示为MSI-H；但是，约5%-11%的MSI发生并不会出现MMR蛋白功能的缺陷，有文献提示两者的一致性为93.7%；
2，dMMR蛋白检测主要包括MLH1，MSH2，MSH6，PMS2；其中尤其需要注意MLH1基因：MLH1蛋白功能缺陷可能是由于MLH1基因启动子区域甲基化引起MLH1基因发生表观遗传学沉默，MLH1甲基化是导致MSI-H的常见原因；此外MLH1蛋白缺失可能是由于BRAF突变所致MMR基因沉默引起的，BRAF突变可能导致MLH1功能缺陷，进而导致MSI-H发生。
3，dMMR包括MMR胚系突变和MMR蛋白缺失，MMR蛋白缺失主要是由MMR基因胚系突变引起，因此，基因检测是最准确判断dMMR的方法（NCCN指南推荐用IHC方法检测dMMR）。
4，MMR基因可以通过基因测序进行检测，但不能直接根据变异情况（非同义突变）提供基因功能异常的证据，无法直接判断MMR蛋白表达/MSI状态；
5，MMR基因非同义突变有时会损失MMR功能，但却保留其抗原性，故能被蛋白能被抗体检测识别，出现假阳性，此时需要PCR检测MSI；
6，MSI常见检测方法为多种荧光PCR法，但不能根据PCR的检测结果直接判断4种MMR蛋白中哪个蛋白功能缺陷，无法通过MSI检测判断与MSI相关的结直肠癌是Lynch综合征还是散发性结直肠癌。
7，微卫星不稳定的检测（MSI）一般是通过毛细管电泳的方式，比较容易在其他癌种当中做到标准化，但MMR的免疫组化评分，从结直肠癌跨越到其他实体瘤中，应该具有什么样的染色标准，四种蛋白之间的正常表达，缺失表达到底是什么判断标准，还需要病理医生多做工作。
延伸阅读
孩子，无论你做什么爸爸妈妈都爱你
我想学生物
找个好人家
一入生物深似海，从此奋斗到天明
Explore the power of genes